第三章
釜底抽薪
GSD上一章说到，STED通过类似橡皮擦的功能来将点扩展函数变小。有同学就说了，我不用橡皮擦，一样能用粗笔画细线！只要找两张纸，对成一个细缝，然后再画就可以了。嗯，的确如此。事实上，很多日常生活中实用的标记，都是这么做的呢！但是，这和我们的超分辨有什么联系呢？
让我们再回头仔细看看能级图：从图中可以看到，如果我们刚开始就把周围的粒子通过一个强激发把它们扔到九霄云外，让他们慢慢自己回到一个不发光的triplet state，这时候能够被激发的就只有中心的粒子，也就自然而然地减小了点扩展函数！一个箭头，扭转乾坤。GSD，全名Ground state depletion，基态清空。
进一步阅读可参考：SW Hell, “Ground-state-depletion fluorscence microscopy: A concept for breaking the diffraction resolution limit”Appl. Phys. B, 60, 495-497 (1995).
当然，你这一点成像没错是超分辨了，但是当你挪到下一点的时候，杯具了！
刚才被你扔到九霄云外的粒子还没有回来！怎么办？两个办法：（一）笨办法，等下去，直到它回来；这样的话，如果粒子在T1及沿途的时间为1毫秒，则你每一个像素的积分时间将不得少于1ms；也就是做一个500x500的图像，你需要4分钟以上。（二）通过并行测量来加快速度。至于怎么实现，且听下回讲到Localization Microscopy的时候分解。未完待续。
如果希望理解更深层的物理背景，可以阅读：http://www.springerlink.com/index/J528591251261MN1.pdf
第四章
RESOLFT
删繁就简二月花前面两篇中，我们讲到了利用STED进行先激发再擦除，或者利用GSD进行先擦除再激发，均可实现超分辨率显微。它们的本质是什么？有没有别的渠道？
上图展示了STED的能级，其中，我们要做的，就是区别红箭头（受激辐射）和黄箭头（自发辐射）。既然如此，把红箭头掰到方向跟黄箭头相反，更容易区分。实验上，完全可以让粒子在激发态的时候keep going，通过Excited State Absorption(ESA)来擦除它。Hell组曾经利用ESA实现了对掺锰的量子点的超分辨。一个箭头，扭转乾坤。
回答我们刚开始提出的问题：本质上，这一类的方法都是抑制粒子处于激发态的几率，也就是不让它在S1态，不管是在摇篮中扼杀(GSD)，到达后拉下来(STED)，还是将其送上西天(ESA)。放一张总结的图，再次欣赏一下这能级上的舞蹈。
这一方法被Stefan Hell称为RESOLFT, reversible saturable/switchable optical transitions，可逆饱和/开关光跃迁。我们讲到的STED/GSD/ESA都可以统一地概括在它下面。在下一章，我们将看到另外两种独辟蹊径的超分辨成像机理，以及它们之间的内部联系。
第五章
STORM
点点春雨入莲池
说起分辨，我国四大名著之一《西游记》中，曾有一个六耳猕猴，让玉帝、唐僧、观音都不能分辨的故事。究其愿意，是因为跟悟空长得太接近了。吴承恩这样写道：“大众听他两张口一样声俱说一遍，众亦莫辨；惟如来则通知之。正欲道破，忽见南下彩云之间，来了观音，参拜我佛。”我佛接下来就识别了六耳猕猴。这段故事大家可能都晓得，但是你知道，如来在观音来之前，讲的是什么经文吗？“那如来正讲到这：不有中有，不无中无。
不色中色，不空中空。非有为有，非无为无。非色为色，非空为空。空即是空，色即是色。色无定色，色即是空。空无定空，空即是色。知空不空，知色不色。名为照了，始达妙音。”常人大概以为吴承恩是为了凑字数赚稿费，没啥实质性意思。这段话绝对有意思！这段话，被一个美女看到了。她嫣然一笑。她就是毕业于中国科技大学少年班的华人，哈佛大学美女教授，新当选美国科学院院士，庄小威。
写到这，必须引入另一个人的工作，Paul R. Silven。Paul说，“其实虽然不能分辨，但是如果横竖就那么一个，那你还是很容易从一个高斯分布的结构中对其精确定位的，就像一座山，如果之前告诉你这个山是高斯正态分布型的，你绝对可以把山顶的位置比较精确地定位，而不是在半山腰量一下山的周长，说，山顶就在这里面儿。
”不知道这个外国人在说这段话的时候最后有没有北京特有的“儿化音”，但是，这一见地却让人振聋发聩。
他给这个方法一个好听的名字：Fiona，FIONA—Fluorescence Imaging with One-Nanometer Accuracy. Paul R. Silven, Myosin V Walks Hand-Over-Hand: Single Fluorophore Imaging with 1.5-nm Localization, Science 2003.好，说说小威是怎么实现从“色即是空”来慧眼分辨的：前面我们说到，当两个发光团太接近的时候，传统分辨率不能分辨。
庄小威的想法就是，如果能够用两种颜色的光，一束管死，通过光漂白，让大部分粒子激发过度到达暗态（死了）；另一束管活，通过激活，就像灵芝草似的，让极个别死去的粒子再活过来。由于活着的是极少数。这样，就有一部分粒子是只有自己发光周边都是不发光的，就可以很容易地把它定位出来；再把它激发、打死，救活另外一些，如此往复。图2庄小威的STORM技术原理。通过“你死我活”的策略，对粒子的定位逐一击破。
就如一场初春的小雨落在池塘，只要雨小，就能通过涟漪跟踪到每滴雨洒落的位置。STORM，全称是Stochastic Optical Reconstruction Microscopy。为什么庄小威会发Science？选对了合适的问题当然是一方面，另一方面是，她发现了一个重要的Cy3-Cy5对，发不同颜色的光，这一对荧光团过去被用在荧光共振能量转移FRET成像研究中。
小威在进行感冒病毒的研究中偶然发现，这一对可爱的蛋白能够像开关一样，通过光控制他们或者发荧光，或者不发荧光。有了开关，就实现了超分辨。开关就是二进制，就是阴阳，就是太极，就是八卦，就是万物。小威，谢谢你，让西方科技世界看到东方哲学之美。发几则《科学网》对庄小威的报道：科学家发明活细胞超分辨率荧光成像技术庄小威：不言放弃的美国院士庄小威获2011年赛克勒国际生物物理学奖（来源：科学网席鹏博客）