经过5年科研攻关，中国科学家培育出世界上⾸只⾼⽐例胚胎⼲细胞“嵌合猴”。这只“嵌合猴”由⻝蟹猴（⻓尾猕猴）的两个基因不同的胚胎的细胞培育⽽来。11⽉10⽇，这项由中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中⼼（神经科学研究所）研究员刘真、孙强和中国科学院⼴州⽣物医药与健康研究院研究员Miguel A. Esteban研究组合作完成的研究，以封⾯论⽂形式在线发表于《细胞》。
“这是该领域⻓期追求的⼀个⽬标。它毫⽆疑问是迄今除了啮⻮类动物之外，利⽤多能⼲细胞产⽣嵌合体动物的最佳实证。”该论⽂多位审稿⼈如是评价。
中国科学院院⼠季维智评价该研究是灵⻓类多能⼲细胞多能性研究的⼀个重要突破，为⼲细胞多能性研究提供了⼀个重要平台，也为后续利⽤⼲细胞建⽴疾病猴模型，通过四倍体补偿法产⽣⼲细胞猴以及体内构建组织器官打下了重要的基础。
胚胎⼲细胞是⽣命发育早期的“种⼦”细胞，具有⽆限⾃我复制更新的能⼒和极强的诱导分化发育潜能。这使得它们在细胞治疗、器官再⽣、类器官模型构建等⽅⾯发挥着重要作⽤。如何证明胚胎⼲细胞具有多向分化潜能呢？⼀个“⾦标准”是将取⾃⼀个囊胚的⼲细胞注射到发育中的另⼀个囊胚内，形成拥有不同基因型的嵌合体。
“理论上，注射的胚胎⼲细胞具有很强的体内发育潜能，可以为嵌合体不同器官的发育作出很⼤的贡献。”论⽂通讯作者刘真在接受《中国科学报》采访时说。
胚胎⼲细胞的发育多能性已在啮⻮类动物中得到了证明。科学家在1984年⾸次实现⼩⿏胚胎⼲细胞胚胎注射形成嵌合体，于2008年成功实现⼤⿏胚胎⼲细胞胚胎注射形成嵌合体。构建⾮⼈灵⻓类胚胎⼲细胞嵌合体技术对⽣物医药研究具有重要意义，然⽽相关研究⼀直进展缓慢。
制造嵌合体，要先把⼲细胞从囊胚内取出放在体外培养，再把体外扩增培养的胚胎⼲细胞重新放回囊胚⽣⻓发育。“⼀出⼀进”之间有两⼤难关。第⼀⼤难关是如何获得具有⾼效发育潜能的胚胎⼲细胞。为突破难关，刘真与合作者选择发育到第7天的⻝蟹猴囊胚分离⼲细胞，这个时期的囊胚已经分裂出约100个细胞，每个细胞都具有⾮常强的分化发育潜能，但尚未开始出现⽅向性的分化。
研究⼈员将分离的⼲细胞放在体外培养，让其保留分裂复制特征，但不再向下分化。
他们最后建⽴了⻝蟹猴的9个⼲细胞系，并将其放置在6种不同的培养体系下对其“健康”进⾏把关。通过单细胞转录组、线粒体代谢、全基因组测序等多⽅⾯系统评估，研究⼈员确定了具有更⾼多能性、更好传代稳定性和基因组稳定性的多个⼲细胞系。第⼆⼤难关是胚胎⼲细胞注射到受体胚胎后的快速凋亡。
为此，研究团队给选出的胚胎⼲细胞标记绿⾊荧光蛋⽩，以追踪⼲细胞存活情况。经过反复实验、试错，他们终于找到了既不影响胚胎正常发育，⼜能保证⼲细胞存活的最优嵌合胚胎培养条件。
2021年初，闯过上述难关的刘真与合作者把选好的⼲细胞注射到早期的猴⼦桑葚期胚胎（发育4~5天的胚胎）中，并将74个具有明显嵌合的囊胚移植到40只受体雌猴体内，最后获得了4只流产的胚胎和6只出⽣的猴⼦。
这些流产的胚胎或活产的猴⼦是否都是嵌合体呢？研究⼈员检测发现，只有1只流产的胚胎和1只活产的猴⼦产⽣了明显的嵌合。“所以，做出嵌合体的成功率约40%，做出活产嵌合体的成功率约20%。”论⽂共同通讯作者孙强对《中国科学报》说。
“虽然效率有限，但结果不算太糟。”刘真说。这个“不算太糟”的结果就是世界上⾸只⾼⽐例胚胎⼲细胞嵌合猴，研究⼈员花费了近3年时间才让它成功降世。
由于⾮⼈灵⻓类嵌合体培养存在巨⼤挑战，2012年，美国科学家在发表于《细胞》的⼀项研究中曾认为，猴胚胎⼲细胞不能产⽣嵌合体，挑战了灵⻓类胚胎⼲细胞多能性理论基础。不过，科学家并未放弃尝试。昆明理⼯⼤学的科学家随后证明猴多能⼲细胞，包括始发态的多能⼲细胞，能够产⽣嵌合体，但嵌合率仅为0.1%~4.5%。
“这表明当时所获得的多能⼲细胞与囊胚期的内细胞团或外胚层，仍存在较⼤差异。”昆明理⼯⼤学省部共建⾮⼈灵⻓类⽣物医学国家重点实验室教授李天晴说。
此次，研究⼈员使⽤绿⾊荧光蛋⽩标签、基因测序以及其他测试⽅法，确认了活产猴⼤脑、⼼脏、肾脏、肝脏和胃肠道中都含有⼲细胞来源细胞的组织类型。在不同组织类型中的贡献从21%到92%不等，在测试的26种不同组织类型中平均为67%。相⽐之下，那只流产嵌合体猴的平均贡献⽐例约为20%。
“这些数据有⼒地证明了猴⼦多能⼲细胞具有在体内分化成各种组织的能⼒。”论⽂共同通讯作者Miguel A. Esteban对《中国科学报》说，“这项研究加深了对灵⻓类动物多能⼲细胞发育潜⼒的理解。”
研究⼈员将取⾃雌性猴⼦胚囊的⼲细胞放⼊雄性胚胎后，发现尽管最终形成的存活嵌合体是雄性，但其⾎液细胞、⽪肤细胞中检测出部分雌性基因。“这很有趣。”孙强说，“它证明了⼲细胞的分化潜⼒，也再次证明了胚胎⼲细胞确实贡献到了嵌合体猴。”
此外，研究团队在两只嵌合体的胎盘组织中都发现了⾼⽐例的胚胎⼲细胞贡献。考虑到此前⼩⿏胚胎⼲细胞⼏乎不会贡献到胎盘组织，说明灵⻓类胚胎⼲细胞可能具有独特的发育全能性。他们在两只嵌合体猴的⽣殖细胞中也发现了胚胎⼲细胞的⾼⽐例贡献，这为构建遗传修饰模型猴奠定了技术基础。
“利⽤灵⻓类多能⼲细胞⽣产嵌合体是这⼀领域⻓期追求的⽬标。原则上，这项研究将为相关基础研究和⾮⼈类灵⻓类遗传修饰模型的产⽣开辟新途径。具体来说，利⽤胚胎⼲细胞实现基因修饰能⼒，将使完成⽬前在受精卵或胚胎阶段使⽤CRISPR技术难以实现的研究成为可能。”⼀位审稿⼈如是评价。
作为⼀名中国本⼟科学家，刘真从研究⽣到博⼠后⼀直在神经科学研究所⼯作。他是⼀名敢于在“⽆⼈区”冒险的科学家。克隆猴是⼀直以来没被解决的问题，甚⾄曾被断⾔不可能解决。2018年，仍在从事博⼠后研究的刘真作为第⼀作者和导师孙强以封⾯⽂章形式在《细胞》发表体细胞克隆猴“中中”“华华”。这⼀科研成果让全球科学界瞩⽬。
此外，刘真作为第⼀作者建⽴的⾃闭症⾮⼈灵⻓类模型、世界⾸例⽣物节律紊乱体细胞克隆猴模型先后发表于《⾃然》《国家科学评论》等期刊。今年4⽉，他作为通讯作者和团队在《细胞-⼲细胞》发表的体外重构⾮⼈灵⻓类类囊胚研究，⾸次将⾮⼈灵⻓类的类囊胚体外培养⾄着床后原肠胚时期。英国⽜津⼤学⼲细胞⽣物学家Alejandro De Los Angeles评论称：“这些发现是⼲细胞类胚胎模型领域的⼀个⾥程碑。”
“做科研⼀定要敢于冒险。”刘真说，“就像研究⽣⼊学时，蒲慕明院⼠讲的那样，要敢于啃‘硬⻣头’。”“我们的⽬标不只是⼀步领先，⽽是要步步领先。”刘真说。
⽣命科学前沿的路并不好⾛。除了科研⽅⾯的难题，每⼀次，刘真与合作者们介绍研究成果时，必然会被“拷问”相关伦理问题。⽐如嵌合体研究是否会带来像希腊神话中“奇美拉”⼀样的怪物。对此，刘真表示，相关研究都遵循了国际国内相关程序，确保远离红线。
“⽬前，我们开展的只是基础科学研究。相关研究未来对基因⼯程技术发展和濒危物种保护有实际意义，可以帮助我们构建更精确的猴模型，⽤于神经系统疾病以及其他⽣物医学领域的研究。”他说，⽐如建⽴“渐冻症”动物模型，推动相关疾病治疗。
下⼀步，研究⼈员希望提升嵌合体猴的培育效率，并进⼀步探索制约嵌合体猴⽣存的因素。据介绍，⾸只胚胎⼲细胞系“嵌合猴”仅存活了10天，其背后的原因⽬前研究团队尚不清楚。他们仅发现嵌合体中由胚胎⼲细胞发育⽽来的细胞和由受体胚胎细胞发育⽽来的细胞在表观遗传修饰上存在⼀些差别。“所以，我们要继续寻找原因。”刘真说。