2018年初，李红良涉嫌造假问题浮现后，本刊连续跟踪报道，有读者提醒其发表在《自然医学》的四篇论文可能还有违反腺相关病毒实验研究常规方面的问题。目前，已有多位AAV基因治疗领域专家向《自然医学》提出质疑。《知识分子》在此提供相关专家意见，以便读者判断——是否因为李红良专业知识缺乏，造成了相关猴子实验可能存在重大纰漏？如果是，相关论文结果该作何解释？
同领域专家一看而知的问题，如果李红良课题组也清楚，那么就进一步提出相关文章可能涉嫌造假。
"猴子有AAV8病毒抗体，AAV8不能用于猴子的基因表达；食蟹猴是野生猴，用于代谢研究背景差异太大，不可能得出文章中那么好的结果。以上问题已有几位教授向期刊质疑。"（舒心梨）
"遇到一个做AAV的资深专家，谈到这个研究，说大多数猴子（大约九成）因为饲养过程中的感染，血清内都有抗AAV的抗体，所以大多数猴子注射AAV之前都需要检测，否则完全不会发挥功能。"（周家喜）
在本刊登出一系列有关李红良《自然医学》论文涉嫌造假的报道后，有几位读者留言，提示本刊其猴子实验可能存在重大纰漏。这些意见认为，因为食蟹猴普遍存在抗AAV的抗体，所以在进行如论文所说的基因治疗之前应对猴子进行筛查。
本刊向AAV基因治疗领域的两位国际专家求证（两位专家分别为：Lili Wang, 宾夕法尼亚大学医学研究副教授；Haiyan Fu，美国哥伦布市全国儿童医院研究所基因治疗中心PI。相关问答请参阅文末）。综合两位专家的意见，她们一致认为，在这个案例中，在猴子实验之前，因为AAV在非人灵长类中广泛存在，应预先筛查猴子体内是否存在AAV8中和抗体，只有AAV8中和抗体阴性的动物才可用于实验。
从2017年至2018年发表的4篇《自然医学》论文（见文末附录之2、3、4、5）来看，李红良课题组没有提到曾对实验猴进行过筛选，看是否有抗AAV8的抗体；此外，从本刊获得的甲乙双方签订的50只猴子的购销合同看，李红良签字代表的甲方Lili Wang Research Associate Professor of Medicine，Gene Therapy Program, Department of Pathology and Laboratory Medicine, Division of Transfusion Medicine, University of Pennsylvania并没有委托乙方（广西防城港常春生物技术有限公司）进行过任何AAV抗体的筛查；从此前举报人霍文哲提供的来自李红良课题组的50只猴的“实验猴个体档案”看，也未列出任何AAV抗体的筛查项目和数据。
此外，两位专家对于李红良课题组在猴子实验7周之后于2016年5月6日进行的AAV8-CFLAR（S1）周围静脉注射，“以确保CFLAR（S1）在肝中的稳定表达”这一做法感到不可理解。
如果确实如李红良课题组回应的，在2016年3月17日至26日进行了50只猴子的肝脏门静脉AAV8注射，隔了不到两个月的5月6日再次进行AAV8-CFLAR（S1）注射，两位专家认为，因为第一次注射所产生的抗体，是不能达到所谓的增强表达的效果的。
有没有做筛查？又为何要做这样一个“无意义”的实验？这些关键的实验环节在论文中没有体现。一个可能的情形是，李红良课题组不了解上述关键问题，其实验设计存在重大纰漏。那么接下来的问题是，论文中声称的AAV8介导的基因是如何成功表达并发挥了显著的治疗效果？
据可靠信源，目前国际上已有多位AAV基因治疗领域的专家向《自然医学》提出质疑。两位专家答《知识分子》问。
问：李红良相关论文中的实验用猴是从广西一个猴场购买后适应了2周，论文没有显示有进行过AAV8抗体检测。利用非人灵长类动物如猴子做以AAV8载体的基因治疗前，是否必须先检测猴子是否感染过AAV8（体内有抗AAV8的抗体）或其它AAV型？答：文章中没有表达转基因或肽的AAV构建体的相关描述，比如，用了什么启动子？文章中没有他们用于生产，纯化和滴定AAV8载体方法的有关描述。
文章中没有提及他们在任何小鼠或猴子实验中使用的AAV8载体剂量。
没有这些信息，任何人都难以重复这些数据。AAV8在猴子中非常流行，尽管不同群落之间的流行程度可能不同。AAV预先存在的中和抗体（NAbs）可能影响AAV静脉递送（I.V.）的结果。
因此，对于静脉递送实验，我们总是预先筛选动物，看是否有预先存在的中和抗体，并且对于大多数实验，我们仅选择没有这些抗体的动物（除非是研究预先存在的中和抗体对转基因的影响）。这两篇论文都没有提到这一点。（编者注：此处两篇论文系附录中受到质疑的李红良论文之4、之5，也即文首报道一中的C文和T文）
问：猴体内的抗AAV8的抗体会影响AAV8载体进入靶细胞，表达其所携带的基因么？
这种影响和注射途径和部位有关么（如周围静脉或肝脏门静脉）？答：在AAV领域众所周知，由于第一次载体注射产生的中和抗体，给已经有免疫活性的动物通过静脉递送相同血清型的AAV载体，这样的重新给药将不起作用。
这个小组在2017年10月的Nat Med（《自然医学》）上发表了一份勘误（参见本文附录李红良受质疑论文之1，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28985205），他们说在方法部分漏掉了信息，在猴实验中，他们第一次注射AAV8-CFLAR(S1) 7周后，还做了第二次AAV8-CFLAR（S1）注射，以确保CFLAR（S1）在肝中的稳定表达。
不知道他们在第二次注射CFLAR（S1）后的表达是不是增加了，可（原则上）这是不可能出现的。
问：即使在没有抗AAV8抗体的情况下，AAV8载体所携带基因的表达有个体差异么？如果有，差异大么？答：是的，即使没有AAV中和抗体，通常，在基因表达水平上，猴子之间也存在差异。大型动物的差异通常要大于小鼠这样的（小型动物）。
问：文中的猴子是从广西一个猴场购买后适应了2周，论文没有显示有进行过AAV8抗体检测。利用非人灵长类动物如猴子做以AAV8载体的基因治疗前，是否必须先检测猴子是否感染过AAV8（体内有抗AAV8的抗体）或其它AAV型？答：在非人灵长类使用AAV8进行基因治疗：已知AAV在非人灵长类中广泛存在，因此抗AAV很常见。
因此，一般来说，在获得动物之前，应该进行筛查血清中是否存在相应AAV血清型的抗体，在这个案例中，应该筛查猴子中是否存在AAV8的抗体。通常，只有AAV8中和抗体阴性的动物才可用于实验,除非实验的目的是调查抗AAV抗体对基因治疗影响。
问：猴体内的抗AAV8的抗体会影响AAV8载体进入靶细胞，表达其所携带的基因么？这种影响和注射途径和部位有关么（如周围静脉或肝脏门静脉）？答：基于血清里抗体的水平多少，已经存在AAV8抗体的确会影响AAV8介导的基因递送的转导效率。已经存在的AAV抗体对静脉（常规周围静脉或通过门静脉）递送的AAV载体的肝脏转导的影响最大。
问：该研究组在猴实验中，在第一次注射AAV8-CFLAR(S1) 7周后，还做了第二次AAV8-CFLAR（S1）注射，以确保CFLAR（S1）在肝中的稳定表达。一些专家认为，这根本不起作用，不知道为何这样做，你如何评论？答：关于该研究组所描述的重新给药，我同意其他专家的意见，没什么意义，因为在第一次注射之后，都会产生很高水平的抗体，因此第二次注射的载体都会被这些抗体清除掉。
问：即使在没有抗AAV8抗体的情况下，AAV8载体所携带基因的表达有个体差异么？如果有，差异大么？答：一般来说，不管哪种AAV血清型，在AAV抗体阴性的动物（包括非人灵长类）中，AAV基因递送转导效率都存在个体差异。