自基因编辑系统CRISPR/Cas9发明以来，CRISPR/Cas9工具箱已经相当丰富，这些工具包括了基因敲除、基因插入、染色体易位、转录控制、特定位点成像等等。近日，中科院神经科学研究所研究员杨辉和北京大学生命科学学院研究员胡家志领导的课题组为CRISPR/Cas9工具箱再添一枚新的工具：整条染色体敲除技术。
整条染色体的敲除是研究染色体功能的重要技术，特别是对于非整倍体导致的疾病机制以及人造染色体研究都至关重要。非整倍体疾病是一种由于增加或缺失一条染色体导致的遗传病，这类遗传病通常具有显著的发病率和死亡率。
近年来，在罕见单基因遗传病中修正基因缺陷取得了很大的进展，现在已经有一些研究组开展了体内研究以及临床试验。相反，在非整倍体细胞中对整条染色体的超剂量基因的纠正的尝试仅有少数。这主要是因为之前开发的整条染色体的敲除方法在实验操作上比较困难，而且无法用于体内实验。
杨辉课题组在研究Y染色体多拷贝基因的敲除时，惊奇地发现在小鼠胚胎干细胞中敲除了多拷贝基因Ssty1, Ssty2和Rbmy1a1会导致雄性胚胎的性别转换。通过荧光杂交和全基因组测序等多种验证，研究者发现这些细胞里的Y染色体消失了，这提示了整条Y染色体被完全敲除了。
这种技术是否可以用于在小鼠模型敲除整条染色体？研究者不禁想到。他们在小鼠受精卵中注射了Cas9的mRNA和在细胞研究中相同的sgRNA，然后将这些受精卵发育到囊胚期，经过检测发现Y染色体被敲除的囊胚比例达到了40%-90%。正常情况下，小鼠的性别比例应为1：1，而将注射了Cas9和sgRNA的受精卵移植回母鼠子宫发育出的幼鼠雌性比例达到了79-90%。
‘雄性小鼠Y染色体被敲除以后，他的基因型就是XO型，最终会发育成雌性小鼠。如果Y染色体能够百分之百敲除的话，小鼠应该是50%XO型，50%XX型，而这两种基因型都会是雌性小鼠。’论文的第一作者、杨辉课题组的左二伟博士解释说。
这些幼鼠中，有26-60%是39条染色体，经过检测这些小鼠只有一条X染色体，而没有同源X染色体或Y染色体。‘我们的方法现在还不能达到百分之百，最好情况下是90%左右，所以只有后代性别比例不能百分之百是雌鼠。’左二伟说。不过，这些实验依然说明了这种方法确实能够在个体水平上敲除一条完整的染色体。
染色体非整倍性会导致一些严重的遗传疾病。例如，缺少一条X染色体会导致特纳综合征，这是一种常见的性发育异常疾病。研究人员用上述的方法在小鼠中敲除了一条X染色体，构建出了特纳综合征的小鼠模型。同时，研究人员还从囊胚中分离出缺失一条X染色体的胚胎干细胞。这些工作为特纳综合征的研究提供了从细胞到个体水平的研究材料，展现了这种技术的应用潜力。
唐氏综合征，又称先天愚型综合征，是由染色体异常（多了一条21号染色体）而导致的遗传疾病。大部分胎儿妊娠期流产，少量出生后智力低下、生长发育障碍。唐氏综合征发生率与母亲怀孕年龄有相关。研究人员从患有唐氏综合征人体内分离出细胞，针对诱导干细胞中21号染色体设计两个sgRNA, 成功高效地删除了多余21号染色体。
最后，研究人员探究了这种方法的分子机制。他们发现，sgRNA破坏单一染色体上在多个位点都存在的重复序列可以导致Cas9在这条染色体上反复切割，从而使修复机制难以成功修复。虽然这是迄今为止整条染色体敲除最简便和高效的方法，但依然有一些问题需要解决。例如，如何大量引入多种sgRNA和切割效率难以预计给这种方法增加了操作难度。
人类的很多疾病与染色体非整倍性相关，例如唐氏综合征和克兰费尔特综合征。利用CRISPR/Cas9系统进行整条染色体敲除给这些疾病机制的研究带来了新的工具。今年8月，澳大利亚的研究者已经发现CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术能够实现在胚胎干细胞和受精卵水平删除Y染色体，而中国学者的研究还实现了X染色体和非整倍体中冗余常染色体的敲除，使得这一研究朝着实用方向更进一步。
‘唐氏综合征目前没有治疗方法。我们方法现在只能在诱导干细胞中做到敲除多余的21号染色体。通过进一步优化我们的染色体敲除技术，使之能够在唐氏综合征患者体内敲除多余的21号染色体，达到治疗唐氏综合征的目的。’左二伟告诉《知识分子》，他们未来将进一步研究整条染色体敲除的机制，以便让这一技术更为简便和高效。