如果将具备基因组定位功能的锌手指蛋白和具备基因组剪刀手功能的FokI核酸内切酶连接在一起，就可以实现对DNA的精确定位和切割。然而转眼20年过去，在学术界之外，锌手指蛋白仍旧是一个极其陌生的名词。20年来，锌手指蛋白身上到底发生了怎样的故事？
王立铭（浙江大学生命科学研究院教授、研究员，国家青年千人计划和浙江省千人计划入选者）书接上回。
我们说到，在1996年，美国约翰·霍普金斯大学的Chandrasegaran实验室发表论文称，如果将具备基因组定位功能的锌手指蛋白和具备基因组剪刀手功能的FokI核酸内切酶连接在一起，就可以实现对DNA的精确定位和切割。人类修改编辑自身基因组的技术图景似乎呼之欲出了。许多人开始畅想未来，也许很快我们可以抛弃传统的“缺啥补啥”基因疗法，用定点打击的方法修复、清理甚至是优化我们的遗传密码了。
转眼20年过去，在学术界之外，锌手指蛋白仍旧是一个极其陌生的名词。它最近一次进入公众视野可能是2014年底。美国宾州大学医学院的一群医生们在著名的《新英格兰医学杂志》发表论文，借助一家名为Sangamo的公司的技术平台，利用锌手指蛋白和核酸酶改造人类免疫细胞，试图治疗艾滋病。由于论文内容是针对12名病人的一期临床试验结果，遵循严格的科学规范和医学伦理，医生们仅仅描述了人体安全性的指标。
而Sangamo公司则按照他们一贯的激进风格，在公司网页上宣称他们的疗法“功能性治愈（functional cure）”了这一世纪顽症。不管读者们信不信，我反正是将信将疑。一切，还是得等到二期和三期临床试验结束才能见分晓。
2014年，来自宾州大学医学院的医生们利用Sangamo公司的锌手指蛋白技术平台，改造了来自患者自身的免疫细胞，以期治疗艾滋病。
这项临床试验的技术关键在于，人类免疫缺陷病毒（HIV）入侵人类免疫细胞需要借助免疫细胞表面的一个名为CCR5的蛋白质受体，在之前的实验室研究中，人们发现破坏CCR5可以有效的阻止HIV的入侵。更有意义的发现是，有极少数CCR5基因天然缺陷的人完全不会被HIV所感染。因此，人工突变人体内的CCR5基因就成了一种可能治疗和预防艾滋病的临床手段。
值得一提的是，CCR5的发现者之一是目前在北京大学任教的邓宏魁教授。
这20年中，在锌手指蛋白身上，到底发生了什么故事？为什么它的应用不是治疗遗传疾病，反倒和八竿子打不着的病毒感染疾病——艾滋病扯上了关系？这家名叫Sangamo的名不见经传的公司是干什么的？我们还能不能期待，在不久的将来，“黄金手指”帮助我们点中疾病的死穴？
先说点题外话。
读者们可能已经从之前的故事里了解到，知识产权保护（主要以专利的形式）对于生物制药行业的极端重要性。以小分子药物为例，大部分小分子药物的化学结构极易获得，甚至在从专利申请到药品说明书的各种法律文件上都必须清楚标明；而同时一旦获知化学结构，通过化学方法合成同样的小分子技术上较为简单。因此在一个完全自由竞争的丛林世界中，小分子制药公司开发出的新药将会在第一时间被虎视眈眈的竞争对手轻易的模仿制造。
为了保护新药开发者，各国政府都制定了大同小异的知识产权保护法规。在包括中国、美国和欧盟在内的世界上大多数国家和地区，创新药物拥有20年的专利保护，在此期间只有专利拥有者（一般也就是药物开发者及其合作伙伴）能够生产和销售这种药物。在专利保护之外，各国监管机构往往还会通过行政手段保障和促进特定药物的开发工作，例如实行所谓“市场保护期”。在保护期内只有药品原始开发者才可以销售这种药物，哪怕专利已经过期。
美国食品药品监督局经常使用市场保护期的规定促进特定药物例如儿科药物、孤儿药等等产品的开发。
应该说，20年左右的“垄断”时间，对于药物开发这个带有显著公共属性的行业来说很可能是精心平衡的结果。这种保护意味着药物研发者有十年左右的时间可以独占市场，充分享受垄断带来的高利润；而在此之后，仿制药厂家的进入会快速降低药物价格，减轻患者和医保买单方的财务负担，让全体人民共享技术进步的成果。
因此在现实的医药市场上，我们看到的是高低端搭配的产品组合：有钱人可以第一时间尝试最新的药物治疗方案，而穷人也可以在众多廉价但是亦有确切疗效的药物中选择。
20年左右的“垄断”时间就像一个定时响起的闹钟，一方面它在敦促制药公司上紧药物开发的发条，因为一旦没有新药源源不断的上市，公司的利润将会断崖式下滑；同时它也不容置疑的将专利过期的药物廉价推送给患者，避免大型制药公司成为高高在上的“吸血鬼”，甚至损害到普罗大众基本的健康权。
Sangamo公司，可以说是这个自我平衡的市场上怪胎一般的存在。
总部位于美国加州旧金山湾区里士满市的Sangamo公司似乎是知识产权保护和市场规律之外的流浪儿。这家成立于1995年的公司，20年来没有一个真正的产品推向市场，药物销售收入严格来说等于零，每年的财报中都是令人触目惊心的赤字。然而它却没有走向衰败和破产，市值反而从2000年上市时的3.75亿美元上升到7亿美元。
与此同时，这家年年烧钱的小公司在20年的时间里成功的把锌手指蛋白及其相关的临床应用锁进了由一系列专利打造的黑箱，把它变成了一个其他所有公司无法染指的垄断市场。甚至连大学里的科学家们也难以使用这项技术，对，别忘了这项技术本来其实是在大学校园中开发出来的！
从某种意义上说，哪怕围绕锌手指蛋白开展的基础研究和临床应用最终被历史所淘汰和遗忘，Sangamo公司的商业实践可能还是会写进许多商学院和法学院的案例教材，被人长久的铭记和讨论。这家公司有什么过人之处？它带给整个医药行业的，到底是成功经验还是教训？
我们已经讲到，早在1996年科学家们已经证明了锌手指蛋白加上FokI核酸酶能够在DNA上实现定点切割。看起来用这个方法定点切割改造人类基因组呼之欲出了。
但这仅仅在理论上而已。在这个时候锌手指还远远不是后来人们心目中的“黄金手指”。第一个技术问题是“可编程性”。我们知道，在形形色色的遗传疾病中，需要定位和改造的基因组DNA位点各有不同。因此在不同的疾病治疗中需要设计和制造专门的“基因组GPS”来实现精确定位，而这正是锌手指蛋白的意义所在。
每一个由30个氨基酸组成的锌手指能够特异性的定位一个DNA三碱基序列，那么理论上，如果细心地选出8个锌手指并组装在一起，我们就可以定位一段预先设定好的24碱基序列，基本上可以保证基因组层面的精确制导了。换句话说，不同锌手指蛋白之间可以自由组合的特性是基因组精确制导的核心所在。
然而早在1991年，美国约翰·霍普金斯大学的卡尔·帕博实验室就利用X射线晶体学，解出了锌手指蛋白的蛋白质三维结构。他们的结果完美说明了一个锌手指是如何识别和结合一段DNA三碱基序列的。然而他们的结果也形象地提示，一个锌手指并不精确覆盖这三个DNA碱基，这根手指还会向前后“延长”出去那么一段，插足到其他相邻的碱基上方。这一点点延长可是意味深长的，它说明锌手指蛋白可能不是完全“可编程”的。
举个例子，如果我们想设计一个锌手指蛋白结合一段12个碱基的DNA序列，姑且用黑龙江—五指山—洞庭湖这9个汉字代表吧，那么我们单独挑选出三个锌手指蛋白分别结合“黑龙江”“五指山”“洞庭湖”，然后穿成一串，很可能是不行的。因为那根对应“黑龙江”的手指还会悄悄地碰到“五”字一点点，而对应“洞庭湖”的手指也会偷偷去戳一下“山”字，这样会干扰彼此对DNA的结合能力。
因此真要选出传说中的“黄金手指”，三根锌手指之间的关系也需要纳入考量。
自然界中已经存在的锌手指有成千上万根，而它们对应的DNA三碱基一共也只有64种变化，换句话说，每一个给定的DNA三碱基，我们有成百上千的候选锌手指可以试用。因此，在可完全编程的美好世界里，挑选几个合适的锌手指，再顺序组装起来，可以说轻而易举。
然而在几根手指还会互相打架的现实世界中，我们总不能把成千上万的手指都两个两个、三个三个，甚至四个四个的配对来试验，从而找出能够和谐相处的手指组合吧！曾经有人做过数学估计，仅仅是三个三个的排列组合来试验目前已知的锌手指，最终可能需要一个像整个北美洲那么大的细菌培养皿才能完成！
那怎么办呢？
我们上文提到过的锌手指蛋白的命名人、1982年诺贝尔化学奖得主阿龙·克鲁格爵士用一个漂亮优雅的方法解决了这个问题。他和合作者们利用一种叫做“噬菌体展示”的方法，分成两步来组装定位“黑龙江—五指山—洞庭湖”的三根锌手指。首先他们分别筛选能够定位黑龙江—五指山的锌手指组合（姑且命名为黑龙江—五指山A），以及定位五指山—洞庭湖的手指组合（姑且命名为五指山B—洞庭湖）。
可想而知，在两个独立的筛选中找到的能够定位五指山的那A和B两根中间手指，很可能是不一样的。不过没关系，如果筛选出的手指组合数量够大，他们总能找到其中相类似的A和B。之后他们就可以根据计算机模拟的方法对A和B加以修饰，最终组装出一套“黄金手指”：黑龙江—五指山A/B—洞庭湖。
听起来是不是够简单？不过要提醒读者们注意的是，在筛选和计算的背后是天文数字的手指组合以及漫长的信息积累，哪些手指组合值得留意？到底怎么计算两根手指的相似性？这些问题筑起了高高的技术壁垒，这一点对我们后面的故事很重要。也正是基于这一点，克鲁格和他的合作者们在英国剑桥创立了Gendaq公司，专攻如何设计针对人类基因组不同位点的制导工具。
有了足够好用的精确制导工具，我们要实现什么样的定点打击呢？
FokI核酸酶给了我们一把基因组剪刀，让我们在它出现的位置把DNA分子咔嚓一刀剪开。但是剪开以后到底干什么用呢？这个问题倒是没有让科学家们操太多的闲心。由于基因组DNA的极端重要性，在细胞核里有许多种蛋白质专门操心它的损伤修复。人们也知道，DNA修复有两种不同的途径，“精确修复”的途径是根据另外一条没有断开的DNA的模样忠实地复原。
而“模糊修复”的途径则是不管三七二十一，先把游离在外的两个DNA线头给撮合到一起再说。两套机理这里我就不详细展开了。在这里我只是强调，两套机理对于我们的故事都非常重要。精确修复的作用在于治病救人：如果基因组上有哪个碱基出了问题，我们可以用剪刀咔嚓剪开，同时给细胞送上一个正确的DNA“模版”，那么断开的问题DNA有很大概率会根据正确信息进行自我修复。
而模糊修复的作用就在于搞破坏，而这个特性对于基础研究则非常有用。在实验室研究中，人们经常需要确定一个基因到底对于生物体有什么功能：是控制某个器官的发育？调节某种行为的发生？帮助生物在逆境中存活？等等。而要发掘和证明这个功能，最直接的办法莫过于“删除实验”，也就是把这个基因给彻底破坏掉，看看生物发生了什么变化。
比如说，如果我们把小老鼠身体里的一个基因破坏掉，发现小老鼠的尾巴不见了，那么我们就确切无疑地知道，这个被我们破坏掉的基因，应该对尾巴的发育至关重要。而基因组剪刀外加DNA模糊修复的特性，恰好提供了一个很方便的在给定基因中引入遗传突变乃至破坏掉其功能的方法。
于是，在2002年，来自美国犹他大学的丹纳·卡罗尔实验室首先证明，人为筛选和组合的两对锌手指蛋白可以精确定位果蝇体内的某个基因，并利用附带的核酸酶剪切创造出携带基因缺陷的果蝇突变体。随后不久，美国加州理工学院的大卫·巴尔迪莫及其合作者马修·波特斯在2003年发表论文，证明如果提供正确的DNA模版，锌手指蛋白和核酸酶的结合能够成功修复出现问题的基因。
于是围绕锌手指蛋白的技术储备终于看起来像模像样了：有了核酸酶这把基因组剪刀，有了我们对于基因组精确和模糊修复机制的了解，有了筛选合适的锌手指蛋白组合的技术平台。且慢，上面讲到的所有发现，都来自非营利性的研究机构（主要是几所大学）。那我们的故事为什么讲着讲着就拐到Sangamo这家公司去了？
要回答这个问题说来话长。
回顾上文中提到的、在“黄金手指”的锻造工程中起到关键作用的科学家，他们全部和Sangamo公司有着密切的联系！Srinivasan Chandrasegaran来自约翰·霍普金斯大学，首先将锌手指蛋白与FokI核酸酶相连，证明其精确定位和剪切功能；Sangamo公司最早的科学顾问（1995-2000年），其融合锌手指蛋白和FokI核酸酶的专利于1995年特许授权给Sangamo公司。
阿龙克鲁格，来自英国MRC分子生物学实验室，1982年诺贝尔化学奖得主，锌手指蛋白命名人，开发了筛选锌手指蛋白组合的技术；他和合作者基于锌手指蛋白筛选平台创立了Gendaq公司，后以三千万美元的价格被Sangamo公司收购，随之转移的还有相关技术的知识产权。他的合作者、筛选平台的实际发明人之一Yen Choo随之加入了Sangamo。而克鲁格本人，目前还是Sangamo科学指导委员会的成员。
丹纳·卡罗尔，来自美国犹他大学，首先证明可以利用锌手指蛋白+核酸酶的组合破坏果蝇体内的基因；其创造基因缺陷的专利于2004年特许授权给Sangamo公司。马修·波特斯和大卫·巴尔迪莫，来自美国加州理工学院，首先证明可以利用锌手指蛋白+核酸酶修复人类细胞中的缺陷基因。后者是1975年诺贝尔生理学或医学奖获得者；其修复基因的专利于2003年特许授权给Sangamo公司。
卡尔·帕博，来自美国约翰·霍普金斯大学，率先解出了锌手指蛋白的蛋白质三维结构，为人们理解其精确定位DNA的机理提供了帮助；其本人干脆在2001-2003年期间，离开学术界加入Sangamo担任首席科学官、资深副总裁。
看到这里读者们可能有些明白，为什么Sangamo公司可以在锌手指蛋白这个完全起源于学术界的领域称王称霸了吧？而这一切，都是Sangamo公司总裁兼首席执行官艾德沃德·蓝菲尔的一盘下了20年的大棋。Sangamo总裁兼首席执行官艾德沃德·蓝菲尔和他的同事、Sangamo公司的创始人和研发负责人飞利浦·格雷戈里。
20年来两人携手整合了关于锌手指蛋白从设计优化到临床应用的整套技术体系，并成功的利用专利壁垒将所有人拒之门外。蓝菲尔并非科学家出身。在创立Sangamo公司之前许多年里，他在旧金山湾区另外一家生物技术公司负责商业拓展业务，而主要的工作就是从学术界和工业界寻找合作伙伴，获得专利授权。当时，蓝菲尔所任职的Somatix Therapy公司致力于开发传统的基因治疗技术。
公司有自己开发的独门基因治疗载体，而且围绕独门治疗载体的专利保护相当完备。但是那些需要被运送进细胞的“货物”，也就是治疗疾病的DNA的专利，却持有在其他公司或学术机构手中。深受只有运输工具没有货物所苦，蓝菲尔的主要工作就是与一家家公司或者大学谈判，希望从他们手中获得这些“货物”的专利授权。
可能是那些年艰难的谈判给他留下太深的印象，蓝菲尔一直希望能创立一家公司，把所有的技术和知识全部据为己有，再也不让同行的专利牵着鼻子走了！
于是甫一看到Chandrasegaran实验室开创性的工作，蓝菲尔果断辞职，从约翰·霍普金斯大学获得了相关专利的特许授权，在此基础上创立了Sangamo公司，并在20年的时间里一步一步、缓慢却坚定不移地把围绕锌手指蛋白的专利一一收入囊中，也把相关技术的世界顶尖专家一网打尽。
终于在2003—2004年，Sangamo获得了包括锌手指蛋白设计、筛选、优化、实验室和临床应用相关的数个关键专利，把一场开始于大学校园的技术革命，成功变成了一场注定只能由Sangamo上演的独角戏。在现代医药产业的历史上，像Sangamo这样成功地利用专利壁垒垄断了整个行业的情景，前无古人，也可能后无来者。
志得意满中，Sangamo启动了针对一系列疾病的药物开发项目。
其瞄准的目标，既有罕见的单基因遗传病例如亨廷顿舞蹈症，也有万众瞩目的艾滋病。截止到2015年，在20年的努力后，Sangamo公司针对艾滋病的两个研发项目分别进入临床一期和二期。因此也可以颇为戏剧性地说，Sangamo公司这两个小规模临床试验的失败，将会决定整个锌手指蛋白研究领域、成百上千科学家、从TFIIIA转录因子被发现的1980年至今30多年来、全部智慧和心血投入的意义。
在已经等得有些不耐烦的资本市场，关于这两个临床试验的结果猜测可以说是满天飞。让我们带着点紧张，带着点希望，也带着点科学的质疑态度，等待临床试验结果的公布吧！
20年后回望，Sangamo公司为我们提供了一个分析专利保护利与弊的绝佳案例。就像本文开头讨论过的那样，医药产品专利保护强度的考量，在于平衡鼓励创新和保障人民健康的两个需求。
专利保护过弱，将打击药物研发企业投入巨资开发新药的积极性；而专利保护过强，将会带来高昂的医疗开支、损害人民基本的健康权。过高的专利壁垒还有一个显而易见的麻烦：确立垄断地位，遏制市场竞争。而我们知道，充分的市场竞争在历史的大多数时间里，都是技术进步的催化剂。
Sangamo公司利用专利壁垒对整个行业长达20年的垄断，在保障这家公司生存、支撑其高昂的研发成本之外，清晰地凸显了这些弊端。
历史的事实是，Sangamo公司的垄断地位实际上显著延缓了整个锌手指蛋白领域的技术进步。学术界的科学家们至今仍无法了解Sangamo公司筛选和优化锌手指蛋白组合的技术细节，在此之上的进一步完善和进步当然无从谈起。而仅靠Sangamo公司内部的少数科学家，要想实现技术的飞速进步又谈何容易。
更有甚者，即便是学术界的科学家想要利用Sangamo公司的技术进行基础研究，例如对某个生物的基因实行定点突变研究其生理功能，也只能知其然不知其所以然地委托Sangamo公司代为设计和完成！本来很有希望在基础研究和临床应用两个方面遍地开花硕果累累的锌手指蛋白，就这样被禁锢在Sangamo公司小小的四方天地里。
我们完全有理由相信，如果锌手指蛋白的相关专利对整个学术界和工业界开放，全球各地的大学实验室争先恐后地改进锌手指蛋白的效率和安全性，全世界的生物制药公司你追我赶地尝试各种疾病治疗方案的开发，20年之后的今天这个领域将发展得无比辉煌。毕竟，整个学术界工业界所能动员的资源、智慧和人手，百千倍于一家小小的Sangamo！然而法律的边界早已被清晰划定。
尽管有些悲伤，我们也不得不尊重Sangamo公司所拥有的知识产权。毕竟，如果知识产权的藩篱可以被随意挪动、修饰和破坏，药物开发公司的创新热情也会如阳光下的冰山一般瓦解。这一点对于当今的中国可能比过度严厉的专利保护更需要让人警惕。而对于层出不穷的生物医学新技术、新方法、新思路，传统意义上的知识产权保护规则是否有修改的必要，可能是留给立法者、执法者和其他利益相关方一道并不容易解答的考试题。
不过亲爱的读者们，科学技术的发展总是能在山重水复中给我们惊喜。在万马齐喑的锌手指蛋白领域，科学家们一直在想办法突破Sangamo的专利藩篱。一系列精彩的发现，在短短数年间，把基因治疗领域带入了我们梦寐以求的编程时代。